DNA骤变是癌症确诊的重要生物标志物，在癌症的前期辨认和搬运监测中发挥着关键作用，尤其是低频骤变。在FDA同意的骤变检测验剂中，124种被指定用于安排活检，47种用在液态物体活检，安排样本仍然是检测DNA骤变的主要是依据。但由于肿瘤异质性高，关于低变异等位基因频率（VAF）的样品，需求查验测验活络度高的办法来防止假阴性成果。另一方面，人类基因组中存在3.1%的骤变热门和0.2%的热门簇，如KRAS（外显子2~4）和TP53（外显子5~8）、EGFR和BRAF基因。这些热门和热门簇与癌症的产生、发展和患者生计有关。例如，BRAF基因骤变热门簇的患者生计率较高，而TP53和EGFR基骤变热门的患者生计率较差。因而，开发能够检测热门区域低频骤变的办法至关重要。
研讨者构建了一种长按捺探针置换扩增技能（Long Blocker Displacement Amplification, LBDA）完成了针对安排样本中肿瘤热门骤变的高活络、高通量检测。该技能依据核酸杂交热力学能的精准调控，使用正向引物和按捺探针之间的链置换反响，并探求了影响杂交热力学能的要素包含温度、盐浓度等，完成对骤变位点扩大检测区间较惯例按捺探针扩增技能高2倍，然后获得了能轻松完成单重探针单管一起检测81个不同的核酸骤变，检测限最低能够到达0.01%。
团队首要探究了针对特定核苷酸规划的单个Long Blocker的按捺才能及其对各种骤变类型的富集才能。将rs10508599 (T)的组成DNA模板界说为野生型模板（WT），将三种类型的骤变(G、C、A)界说为骤变型模板（MT），并依据WT序列规划长阻断剂。
依据试验成果，LBDA能够在一次反响中检测到低至0.5%变异等位基因频率(VAF)的不同骤变类型，与野生型比较，21个骤变DNA模板的中位富集倍数为1000倍。LBDA能够在富集区富集一切与WT序列不同的变异。
依据世界癌症研讨机构(IRAC)的陈述，结直肠癌是全球第三大盛行癌症，也是导致癌症相关逝世的第二大原因。KRAS和NRAS骤变在结直肠癌中很常见，常常产生在骤变热门。
因而研讨者使用LBDA-qPCR检测KRAS和NRAS骤变热门，使用单条Long Blocker能够掩盖81个骤变类型（数据参阅COSMIC），在组成模板和结直肠癌安排样本中别离进行了测验。此外，经过Sanger测序验证骤变类型，与下一代测序成果共同。
本研讨中LBDA-qPCR办法是检测癌症中低频骤变的一种有用而活络的东西，特别是能够富集骤变热门簇的区域。试验中单个Long Blocker能够富集高达44 nt的各种骤变类型，一起仅用20 ng DNA输入就能够完成10,000倍的骤变富集。研讨者规划用于检测KRAS和NRAS骤变的LBDA-qPCR。在临床样本中测验的成果提醒了断直肠癌安排中肿瘤的异质性，以及安排与血液样本之间的异质性。总归，LBDA-qPCR具有高通用性和高活络度，是一种全面、活络地检测癌症遗传变异的有用办法。
时间: 2024-07-07 11:38:21 | 作者: 产品中心
